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    要一次进行这么多种反应，我们当然不想在反应中缺了哪个组分。一般多重PCR需要更多的dNTP、镁离子和聚合酶。Nichols推荐使用0.3 mM dNTP（而非标准的0.2 mM）、2.5 mM Mg2+（而非1.2至2 mM）以及每50μL反应体系5 units聚合酶（而非1.25 units）。zui后再试试盐浓度，“在优化的时候，增加盐总会有帮助，尤其能增加特异性。” ELISA试剂盒

    PCR master mix含有缓冲液、盐、dNTP、Mg和聚合酶，如果我们使用常规1.25× 或1.5×的PCR master mix就已经差不多做到了上述原则的三至五。另外，您还可以选用转为多重PCR优化的产品，例如NEB的多重PCR 5× Master Mix、Bio-Rad的iQ? Multiplex Powermix、或者安捷伦的Brilliant Multiplex QPCR Master Mix。

    据安捷伦的Mason介绍，Brilliant Multiplex QPCR Master Mix是经过专门设计的，能够很好的解决同一管中不同反应相互竞争的问题。如果一个目标片段出现1000次，而另一个目标片段只出现了10次，那么后一个片段就很容易沦为背景。“我们的多重PCR试剂盒能够在同一个管中准确定量低丰度和高风度的目标片段，克服偏向性，”Mason说。

    我能扩多少目标片段一般来说，zui多能在同一个管中同时检测到五个目标片段，这既是出于引物设计的考虑，也是由多重定量PCR的硬件条件决定的。实时荧光PCR仪通常zui多检测4至5个颜色通道，其中一个可能还要留作参考通道。凝胶电泳虽然不受此限制，但多引物一同作用仍然存在困难，因此还是zui多达到五重PCR。 “设计更多是挑战性的，”Cockrum说。

    多重定量PCR的染料能进行多重定量PCR的仪器包括：Life Tech公司的QuantStudio? 12K Flex Real-Time PCR System、安捷伦公司的Mx30005P等等。目前zui流行的选择是HEX、FAM和VIC，而FAM/HEX和FAM/VIC是用的zui普遍的。Life Tech除了VIC外，近期又发布了两个新染料ABY和JUN以及一个新passive reference dye——Mustang Purple。 ELISA试剂盒

    Cockrum建议将染料强度与模板丰度结合起来，用zui亮的染料（通常是FAM）配zui少的模板，用zui黯淡 的染料（例如Cy5或Quasar 705）配丰度zui高的模板（如看家基因）。

    更多重的PCR当然，引物设计是多重PCR的zui大障碍，不过一旦克服了这一障碍我们就能进行更多重的PCR反应。安捷伦的MassCode技术就能够超越定量PCR仪带来的硬件限制，安捷伦公司将这一技术推荐给那些想要同时筛选十个以上目标片段的用户，例如可以用来检测病原体。 ELISA试剂盒