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1 、转染前细胞的处理(以 24 孔板培养为例):
贴壁细胞:在转染前一天,在 24 孔板内铺上 0.5×105 细胞, 500ul 无抗生素培养基培养一天,到转染时使细胞达到 80 %~ 90 %的汇合率。
悬浮细胞 : 在制备混合物前,将 4—8×105 细胞用无抗生素培养基培养铺铺于 24 孔板内。
2 、转染方法(以质粒 DNA 转染为例)
2.1 、将 DNA 质粒溶于 50ul 无血清的 Opti - MEM Ⅰ Reduced Serum Medium 中。混合均匀。
2.2 、将适量 Lipofectamine 2000 溶于 50ul 无血清的 Opti - MEM Ⅰ 中,混合均匀。在室温下孵育 5 分钟(在 25 分钟内进行步骤 c )。
2.3 、孵育 5 分钟后,将上述两种混合物混合(总体积 100ul )。轻轻混合均匀在室温下孵育 25 分钟(可能出现雾状沉淀)。复合无在室温下六小时内稳定。
2.4 、在 24 孔板中每孔加入 100ul 的复合物以及适量培养基。十字法混合均匀。
2.5 、细胞在 37 。 C CO2 培养箱中培养 18 - 48 个小时后,测量转染效率。在加完复合物 4 - 6 小时候可更换培养基。
3 、转染注意事项
3.1 、转染严格来说,每种细胞的条件是不一样的,如果实验时,不能确定*转染条件,请在细胞实验组共享文件夹查找类似细胞的转染方法;
3.2 、转染结果的好坏,与 DNA 质量密切相关,务必在实验之前对去内毒素质粒 DNA 的质量进行严格鉴定,至少采用以下两种方法:琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度检测,如果有条件,可对质粒 DNA 去内毒素质量的进行检测。
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展会城市:深圳市 展会时间:2024-10-14