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2011年06月23日 10:30:42人气：7281来源：上海玉博生物科技有限公司

MTT 原理

MTT 全称为 3-（4,5）-dimethylthiahiazo （-z-y1）-3,5-di- phenytetrazoliumromide ，汉语化学名为 3-（4 ， 5- 二甲基噻唑 -2）-2 ， 5- 二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。是一种黄颜色的染料。

MTT 比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性 MTT 还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（ Formazan ）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（ DMSO ）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在 490nm 波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内， MTT 结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。
缺点：由于 MTT 经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测。这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲的有机溶剂对实验者也有损害。

MTT 溶液的配制方法
通常，此法中的 MTT 浓度为 5mg/ml 。因此，可以称取 MTT 0.5 克，溶于 100 ml 的磷酸缓冲液（ PBS ）或无酚红的培养基中，用 0.22μm 滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放 4 ℃ 避光保存即可。在配制和保存的过程中，容器用铝箔纸包住。实验的时候我一般关闭超净台上的日光灯来避光，觉得这样比较好。
需要注意的是， MTT 法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能测定细胞数。在用酶标仪检测结果的时候，为了保证实验结果的线性， MTT 吸光度在 0-0.7 范围内。

MTT 一般现用现配，过滤后 4ºC 避光保存两周内有效，或配制成 5mg/ml 保存在 -20 度长期保存，避免反复冻融，小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。我一般都把 MTT 粉分装在 EP 管里，用的时候现配，直接往培养板中加，没必要一下子配那么多 , 尤其当 MTT 变为灰绿色时就不能再用了。

MTT 有致癌性，用的时候小心 , 有条件带那种透明的簿膜手套 . 配成的 MTT 需要无菌， MTT 对菌很敏感；往 96 孔板加时不避光也没有关系，毕竟时间较短，或者你不放心的时候可以把操作台上的照明灯关掉 .

配制 MTT 时用 PBS （ ph=7.4 ）溶解。 PBS 配方： Nacl 8g ＋ Kcl 0.2g ＋ Na₂HPO₄ 1.44g ＋ KH₂PO₄ 0.24g 调 pH 7.4, 定容 1L 。

普通 MTT 法实验步骤：
1 ：接种细胞：用含 10 ％胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔 1000-10000 个细

胞接种到 96 孔板，每孔体积 200ul.
2: 培养细胞：同一般培养条件，培养 3-5 天（可根据试验目的和要求决定培养时间）。
3 ：呈色：培养 3-5 天后，每孔加 MTT 溶液（ 5mg/ml 用 PBS 配制， pH=7.4）20ul. 继续孵育 4 h ，

终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。

每孔加 150ul DMSO ，振荡 10min ，使结晶物充分融解。
4 ：比色：选择 490nm 波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为

横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。

药物 MTT 法实验步骤
贴壁细胞：
1: 收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入 100ul, 铺板使待测细胞调密度 1000-

10000 孔，（边缘孔用无菌 PBS 填充）。
2: 5%CO₂ ， 37 ℃ 孵育，至细胞单层铺满孔底（ 96 孔平底板） , 加入浓度梯度的药物 , 原则上，

细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午

加药 . 一般 5-7 个梯度 , 每孔 100ul, 设 3-5 个复孔 . 建议设 5 个，否则难以反应真实情况
3: 5%CO2 ， 37 ℃ 孵育 16-48 小时，倒置显微镜下观察。
4: 每孔加入 20ulMTT 溶液（ 5mg/ml ，即 0.5%MTT ），继续培养 4h 。若药物与 MTT 能够反应，

可先离心后弃去培养液，小心用 PBS 冲 2-3 遍后，再加入含 MTT 的培养液。
5: 终止培养，小心吸去孔内培养液。
6: 每孔加入 150ul 二甲基亚砜，置摇床上低速振荡 10min ，使结晶物充分溶解。在酶联免

疫检测仪 OD490nm 处测量各孔的吸光值。
7: 同时设置调零孔（培养基、 MTT 、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介

质、培养液、 MTT 、二甲基亚砜）。

悬浮细胞：
1: 收集对数期细胞，调节细胞悬液浓度 1×106/ml ，按次序将 ① 补足的 1640 （无血清）培

养基 40ul ； ② 加 Actinomycin D （有毒性） 10ul 用培养液稀释（储存液 100mg/ml ，需预试寻找*稀释度， 1:10-1:20）； ③ 需检测物 10ul ； ④ 细胞悬液 50ul （即 5×104cell/ 孔），共 100ul 加入到 96 孔板（边缘孔用无菌水填充）。每板设对照（加 100ml 1640 ）

2: 置 37 ℃ ， 5%CO2 孵育 16-48 小时，倒置显微镜下观察。
3: 每孔加入 10 ul MTT 溶液（ 5 mg/ml ，即 0.5%MTT ），继续培养 4 h 。（悬浮细胞推荐使用

WST-1 ，培养 4 h 后可跳过步骤 4 ），直接酶联免疫检测仪 OD570nm （ 630nm 校准）测量各孔的吸光值）

4 、离心（ 1000 转 x10min ），小心吸掉上清，每孔加入 100 ul 二甲基亚砜，置摇床上低速振荡 10 min ，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪 OD570nm （ 630nm 校准）测量各孔的吸光值。

5 、同时设置调零孔（培养基、 MTT 、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、 MTT 、二甲基亚砜），每组设定 3 复孔。

注意事项：
（1）选择适当得细胞接种浓度。
（2）避免血清干扰：一般选小于 10 ％的胎牛血清的培养液进行试验。在呈色后尽量吸尽孔

内残余培养液。
（3）设空白对照：与试验平行不加细胞只加培养液的空白对照。其他试验步骤保持一致，

zui后比色以空白调零。

（4） MTT 实验吸光度zui后要在 0-0.7 之间，超出这个范围就不是直线关系。

（5）用 96 孔板培养细胞做 MTT 测细胞活力 , 应该加多少 1640 培养基 , 多少 MTT 和 DMSO 合适

根据书上说的加 200ul1640,20ulMTT,150ulDMSO 加 DMSO 之前要尽量去掉培养液，便于

DMSO 溶解甲臜颗粒进行比色测定

（6）一般每孔 4000 个细胞为宜，既细胞浓度在 20000 个 /ml ， MTT 加 20ul ，作用四小时后洗掉上清液，注意不要将甲瓉洗掉，然后每孔加 150ul DMSO ，在脱色摇床上振荡 10 分钟，然后测吸光值。

关键词：倒置显微镜显微镜

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