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补体法
1.材料
(1)免疫血清 60℃ 灭活 20 min,用 Kolmers 盐水作 2 倍稀释成 1:2,1:4,1:8……。补体用 1:10 稀释的新鲜豚鼠血清,抗补体荧光 抗体 等,按下述的补体法染色。免疫血清补体结合的效价,如为 1:32 则免疫血清应作 1:8 稀释。
(2)补体用新鲜豚鼠血清一般作 1:10 稀释或按补体结合反应试管法所测定的结果,按 2 单位的比例,用 Kolmers 盐水稀释备用。Kolmers 盐水配法:即在 pH7.4、0.1mol/L 的磷酸缓冲盐水中,溶解 MgSO4 的含量为 0.01% 浓度。
(3)抗补体荧光 抗体 :在免疫血清效价为 1:4,补体为 2 单位的条件下,用补体染色法测定免疫豚鼠球蛋白荧光抗体的染色效价,然后按染色效价 1:4 的浓度用 Kolmers 盐水稀释备用。
2.方法步骤
(1)涂片或切片固定。
(2)吸取经适当稀释之免疫血清及补体之等量混合液(此时免疫血清及补体又都稀释一倍)滴于切片上,37℃ 作用 30 min,置于保持一定湿度的染色盒内。
(3)用缓冲盐水洗 2 次,搅拌,每次 5 min,吸干标本周围水液。
(4)滴加经过适当稀释之抗补体荧光抗体 30 min,37℃,水洗同(3)。
(5)蒸馏水洗 1 min,缓冲甘油封固。
3.对照染色
(1)抗原对照。
(2)抗血清对照:用正常兔血清代替免疫血清。
(3)灭活补体对照:将补体经 56℃30 min 处理后,按补体同样比例稀释,与免疫血清等量混合后,进行补体法染色。
本法之荧光 抗体 不受免疫血清的动物种属的限制,因而一种荧光抗体可作更广泛的应用,敏感性亦较间接法高,效价低的免疫血清亦可应用,节 省免疫血清,尤其是对检查形态小的如立克氏体、病毒颗粒等或浓度较低的抗原物质时甚为理想。
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